37° 55′ 55.37″ N, 122° 1′ 20.1″ W
Die Genfabrik des Joint Genome Institutes im kalifornischen Walnut Creek wirkt nicht gerade wie der Ausgangspunkt der biologischen Revolution. Doch in diesem 5600 Quadratmeter großen Industriebau, der ein wenig abseits des von Bäumen gesäumten Mitchell Drives liegt, wurde ein Großteil des menschlichen Genoms sequenziert.
1997 richtete das amerikanische Department of Energy das Joint Genome Institute ein, um die Arbeit zu vereinen, die von den landesweit verstreuten Laboratorien des Department of Energy durchgeführt wurde. Das in Walnut Creek angemietete Areal wurde zu einem neuen Labor umgebaut, das Teil des Human Genome Project war.
1990 wurde unter der Leitung von James Watson (dem Mitentdecker der DNA-Struktur; siehe Kapitel 71) das Human Genome Project ins Leben gerufen, mit dem Ziel, das menschliche Genom bis zum Jahr 2005 zu sequenzieren. Bei der Sequenzierung eines DNA-Segments wird dieses in seine Grundelemente, die vier Nukleotide Thymin (T), Adenin (A), Guanin (G) und Cytosin (C), aufgespalten und es wird ermittelt, in welcher Reihenfolge diese auftreten.
Die Nukleotide binden sich in Paaren (A mit T und C mit G), die als Basen bezeichnet werden. Die Paare können sich in beiden Richtungen verbinden (d.h. ein AT-Paar ist ebenso möglich wie ein TA-Paar). Bei der fachlichen Kommunikation über DNA-Sequenzen wird der Einfachheit halber immer nur eine Hälfe des Paares angegeben.
Die Sequenz der Basenpaare und damit die Sequenz der Buchstaben A, T, C und G ergibt den genetischen Code eines jeden lebenden Organismus. Die Paare werden in der DNA miteinander verknüpft und zur Produktion von Aminosäuren genutzt. Diese Aminosäuren dienen dann der Herstellung von Proteinen.
Der bovine Circovirus (ein einfacher Rindervirus) besitzt zum Beispiel eine DNA-Sequenz aus 1768 Paaren:
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Das Human Genome Project hatte sich zum Ziel gesetzt, die Sequenz der Nukleotide im Menschen zu bestimmen. Das war aufgrund der Anzahl der Basenpaare (etwa drei Milliarden) eine riesige Herausforderung. Mithilfe einer als Shotgun Sequencing bezeichneten Technik (siehe Kasten) konnte die Aufgabe bereits im Jahr 2003 abgeschlossen werden, zwei Jahre früher als geplant. Das gesamte menschliche Genom kann man sich im Web unter http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/ansehen.
Glücklicherweise bietet das Joint Genome Institute kostenlose Führungen durch die Einrichtung an. Die Führungen dauern etwa eine Stunde. Dabei können die Besucher das Equipment für die DNA-Sequenzierung ganz aus der Nähe betrachten. Erläutert wird zunächst das Institut selbst, im Anschluss dann die Geschichte der DNA-Sequenzierung und abschließend das Human Genome Project. In der Führung eingeschlossen ist auch die Robotermaschinerie, mit der die DNA automatisch zerlegt wird, um deren Sequenz zu bestimmen.
Informationen zum Joint Genome Institute finden Sie unter http://www.jgi.doe.gov/education/tours.html. Es ist unumgänglich, im Voraus eine entsprechende Führung zu buchen.
Shotgun Sequencing
Die Verarbeitung eines Genoms von einer Größe, wie sie beim Menschen gegeben ist, erfordert eine Methode, die für die Arbeit mit Milliarden von Basenpaaren geeignet ist. Die Methoden, die für Organismen mit kurzen Genomen (wie es bei dem bereits genannten bovinen Virus der Fall ist) verwendet wurden, waren dieser Aufgabe nicht gewachsen. Gegen Ende der 1970er kam die Idee auf, lange DNA-Stränge in kürzere Fragmente aufzuteilen und diese dann zu sequenzieren. Bei dieser Technik wurden Computer eingesetzt, um die Original-DNA später aus den Fragmenten wiederherzustellen. Das Verfahren wurde als Shotgun Sequencing bekannt.
Beim Shotgun Sequencing wird ein langer DNA-Strang mittels eines Geräts mit dem Namen HydroShear zerlegt. Die DNA wird verdünnt und durch kleine Löcher in einen Rubin gedrückt. Während die DNA durch diese Löcher fließt, wird sie durch den Flüssigkeitsdruck gestreckt und bricht an zufälligen Stellen auseinander. Leider bringt dieser Prozess die DNA-Fragmente durcheinander und es ist recht schwierig, sie wieder in der richtigen Reihenfolge zusammenzusetzen.
Die resultierenden DNA-Fragmente werden zunächst in ein Plasmid (ein Stück DNA, das von einem Bakterium angenommen und in dessen eigene DNA eingebunden werden kann) eingefügt. Dieses speziell präparierte Plasmid pUC18 enthält zwei zusätzliche, sehr nützliche DNA-Anteile – einer bietet antibiotische Resistenz und der andere färbt die Bakterien, die es aufnehmen, blau.
Die so präparierten Plasmide werden dann in einer Lösung mit E. coli-Bakterien gemischt. Die Bakterien werden (elektrisch) angeregt, das Plasmid und die drei DNA-Teile aufzunehmen. Dann werden Sie mit einem Antibiotikum behandelt, um alle Bakterien abzutöten, die sich das DNA-Plasmid nicht einverleibt haben. Übrig bleibt eine Population speziell präparierter E. coli-Bakterien, die sich Reproduzieren können und so die ursprünglichen DNA-Fragmente replizieren.
Nun dürfen die E. coli-Bakterien wachsen und Kolonien bilden. Einige Kolonien färben sich blau (weil sie das Plasmid angenommen und eingebunden haben), während die anderen weiß bleiben (weil sie das Antibiotikum überlebt haben, obwohl sie das Plasmid nicht korrekt eingebunden haben). Ein mit einer speziellem Kamera ausgestatteter Roboter pickt sich die blauen Bakterien heraus. Deren Anzahl kann dann weiter wachsen, bis Milliarden von E. coli-Bakterien vorhanden sind, alle mit Kopien der zu sequenzierenden DNA-Fragmente.
Ein weiterer Roboter platziert die Bakterien in einer Maschine, in der sie auf 95°C erhitzt werden. Dadurch brechen die Bakterien auf und die Plasmide mit den DNA-Kopien werden freigeben. Anschließend werden die DNA-Basenpaare in weiteren chemischen Reaktionen mit fluoreszierenden Farben eingefärbt (die entsprechenden Arbeitsgänge werden dabei größtenteils ebenfalls wieder von Robotern durchgeführt). Jedes Basenpaar erhält eine andere Farbe, sodass die jeweilige Basenpaar-Sequenz anhand der Farben identifizierbar ist.
Die DNA wird dann durch eine Kapillare in eine Maschine geleitet, die die eingefärbten Basenpaare mithilfe eines Lasers »lesen« kann, und so die DNA-Sequenz des DNA-Fragments festhält. Doch bei diesem Vorgang können nur die ersten etwa 1000 Basenpaare jedes Fragments verarbeitet werden. Aus diesem Grund ist der ganze Prozess so konzipiert, dass viele Kopien der DNA in viele verschiedene Fragmente aufgeteilt werden, die dann partiell sequenziert werden. Da diese Fragmente zufällige DNA-Segmente sind, liegt die gleiche DNA-Sequenz in vielen verschiedenen Fragmenten vor. Mithilfe dieser überlappenden Fragmente kann ein Computer die passenden Sequenzen zusammenfügen, um dann ein vollständiges Bild der DNA zu entwickeln.
Mit einer speziellen Software (siehe Abbildung 88.1) werden dann die aus den Fragmenten ermittelten Sequenzen untersucht. Anschließend wird diesen ein Qualitätsmaß zugewiesen (um festzulegen, wie verlässlich die Identifikation des Basenpaares ist). Eine andere Software, die an der Universität von Washington konzipiert wurde, fügt dann die passenden Fragmente wieder zusammen.
